植物叶绿体提取试剂盒

● 产品简介：

叶绿体（Chloroplast）是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器，是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5~10μm，短径2~4μm，厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50～200个叶绿体，可占细胞质的40%，叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成，含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔。本公司的植物叶绿体提取试剂盒采用密度梯度离心方法，可以从多种植物中提取高纯度的叶绿体。

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 试剂盒可以用于叶绿体粗提，所得叶绿体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析。也可以用于叶绿体精提，所得叶绿体完整，可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜，基质，类囊体，叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。

3. 以每次处理30 g叶片计算，本产品可使用8-10次提取，每次能得到3-5 mg左右叶绿体。

4. 已经成功用于菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等植物，还可用于更多植物（可能需要优化条件）。

● 贮存及运输：

4-8℃保存，至少一年有效;试剂盒常温运输。

● 产品组成：

● 使用说明：

注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

1.1 材料预处理：

实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片的放置时间也不能超过一天。

1.2  1×叶绿体提取缓冲液（即用型）配制：

注：一个30克样品提取反应需要 135 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）。

1.3 叶片匀浆：

1.3.1 新鲜采集植物叶片（约30克），快速去除叶脉并将叶片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在适量的预冷的1×叶绿体提取缓冲液（即用型）中（每克叶片加4 ml）。

1.3.2 将浸泡了叶片的溶液转移到Waring匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机）中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒。注意：除Waring匀浆机外，还可以选择Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨（加玻璃珠）等裂解细胞的方法，但这些方法的单次处理量都比较小，需要将样品分成很多小份单独匀浆，然后再汇集。

1.3.3 用过滤筛过滤匀浆液，可先将滤液收集到预冷的200 ml量筒中，再等分到4个预冷的50 ml的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35 ml）。过滤筛可以反复使用。

1.4 离心去杂质：

在水平转子离心机上4℃ 200 g离心15分钟，沉淀为未破裂植物组织、的细胞或细胞核。

1.5 收集叶绿体粗提液：

1.5.1将上清液（含叶绿体）转移到一个新的预冷的50 ml塑料离心管中。

1.5.2. 在水平转子离心机上4℃ 1100 g离心15分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体，呈浅绿色。

1.5.3 在沉淀中加入1.5 ml 预冷的1×叶绿体提取缓冲液（即用型），手弹离心管底部使叶绿体重悬，收集4管溶液（约6 ml），此溶液即为叶绿体粗提产物（含有破碎的叶绿体和完整的叶绿体），可直接用于后续的SDS-PAGE，Western，蛋白组分析。注意：重悬时最好避免溶液起泡，也不要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象，但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。

1.6 完整叶绿体的纯化：

1.6.1 密度梯度重液配制：

在15 ml塑料离心管中先加入0.5 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和2 ml密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得80%密度梯度重液。

1.6.2密度梯度轻液配制：

在另一试管中将3 ml 1×叶绿体提取缓冲液（即用型）和2 ml 密度梯度分离试剂，充分混合均匀，得40%密度梯度轻液。

1.6.3 将密度梯度轻液小心铺在密度梯度重液之上，然后将第步骤1.5.3得到的叶绿体重悬液小心铺在密度梯度轻液之上。

1.6.4  在水平转子离心机上4℃ 3200 g离心15分钟(注：为了避免离心时损伤叶绿体，可调低离心机的升速和降速)，最上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等，重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体（如下图）。

1.7.1 1×叶绿体提取缓冲液（不加BSA，不加DTT）配制：

1.7.2 重悬叶绿体：

用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带（叶绿体）转移到新的离心管中，加入三倍体积预冷的1×叶绿体提取缓冲液（不加BSA，不加DTT），轻柔混匀。

1.7.2 离心收集叶绿体：

在水平转子离心机上4℃ 1750 g离心3-6分钟，小心将上清倒出后，在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的0.5 ml 1×叶绿体提取缓冲液（不加BSA，不加DTT），手指轻弹管底使叶绿体重悬。

1.7.3 将叶绿体重悬液转移到1.5 ml离心管中并避光保存，也可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。所得精提叶绿体可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜，基质，类囊体，叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化实验等。

1.8 叶绿素A含量测定（可选）：

通常叶绿体含量用单位叶绿素a含量来表示，即x mg 叶绿素a/ml 叶绿体悬浮液。

1.8.1 取20 μl 叶绿体悬浮液加入到980 μl 80%丙酮溶液中，混匀。

1.8.2 3000 g 离心5分钟，保留上清，测定OD₆₅₂ 吸光值，用80%丙酮做空白对照。

1.8.3 根据以下公式计算叶绿素a：

叶绿素a浓度（mg/ml）=（OD₆₅₂×50）/36

50：稀释倍数

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

1.9 实验示例：