氨苄青霉素（AMP）酶联免疫分析（ELISA）

1 使用目的：本试剂盒用于微生物，植物，饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），鸡蛋、蜂蜜、牛奶、羊奶，血清和尿样中氨苄青霉素（AMP）残留的定量检测。 

2 实验原理本试剂盒采用竞争 ELISA 方法，在微孔板包被有氨苄青霉素（AMP）偶联抗原，加入氨苄青霉素（AMP）标准品或样品，游离氨苄青霉素（AMP）与微孔条上预包被的氨苄青霉素（AMP）偶联抗原互相竞争抗氨苄青霉素（AMP）抗体酶标记物，用 TMB 底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 波长下进行检测，吸光值与样品中氨苄青霉素（AMP）含量成反比，通过标准曲线计算样品中氨苄青霉素（AMP）的含量。 

3 试剂盒组成 

3.1 预包被的氨苄青霉素（AMP）偶联抗原的可拆酶标板：1 块（12 孔×8 条）。 

3.2 氨苄青霉素（AMP）标准品：6 瓶（1ml/瓶），含量分别是：0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7ppb,8.1 ppb。 

3.3 抗氨苄青霉素（AMP）抗体酶结合物：1 瓶（6ml）。 

3.4 显色液 A：1 瓶（6ml）。 

3.5 显色液 B：1 瓶（6ml）。 

3.6 终止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。 

3.7 样本稀释液：1 瓶（10×, 6ml），用于样品稀释用。 

3.8 浓缩洗涤液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。 

3.9 说明书一份。 

4 需要而未提供的材料 

4.1 设备 

4.1.1波长450nm酶标仪。 

4.1.2粉碎机。 

4.1.3量筒。 

4.1.4振荡器。 

4.1.5漏斗。 

4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。 

4.1.7微量移液器。 

4.2 试剂 

4.2.1去离子水或蒸馏水。 

4.2.2 甲醇。 

5 贮存 

5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻

5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存 

6 注意事项 

6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。 

6.2 不要使用过期试剂盒。 

6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。 

6.4 标准品中含有氨苄青霉素（AMP），使用时应特别注意，操作时应带手套。 

6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。 

6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。 

6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。 

6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果 

6.9 混合试剂时应避免起泡。 

7 工作液准备 

7.1 氨苄青霉素（AMP）标准品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb 

7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用 

7.3 样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用7.3 显色剂：已备用，避免光线直照 

7.4 反应终止液：已备用 

8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存） 

8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液 

8.2强力振荡3分钟 

8.3用Whatman No 1滤纸过滤 

8.4取25µl处理后的样品，加入25µl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2） 

9 酶免分析步骤 

9.1 实验须知 

9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。 

9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存 

9.1.3 请不要改变分析程序 

9.1.4 请使用精确的微量移液器 

9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序 

9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作 

9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样 

9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面 

9.2 分析步骤 

9.2.1 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测 

9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存 

9.2.3 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释) 

9.2.4 在B0孔中加入50µl 0.0ppb标准品溶液 

9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液

9.2.6 在各样品孔中加入50µl样品溶液 

9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗氨苄青霉素（AMP）抗体酶结合物 

9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。 

9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差） 

9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。 

9.4 反应 

9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加 50µl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀 

9.4.2 37℃温浴10min 

9.4.3 每孔中加入50µl终止液，混匀 

9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。10 结果计算10.1定量分析10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值10.1.2以氨苄青霉素（AMP）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为氨苄青霉素（AMP）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中氨苄青霉素（AMP）浓度C（ppb）10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。10.2 半定量测定10.1.1目测半定量测定： 首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。11 特异性物质 交叉反应氨苄青霉素（AMP） 100%12 试剂盒参数本试剂盒检测下限为0.1ppbB0吸光度最佳值应大于1.0试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。13试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.1ppb。14 分析限制本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证